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一种重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的纯化方法
技术领域
本发明涉及一种重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的纯化方法。属于兽用生物制品领域。
背景技术
猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）是猪圆环病毒科圆环病毒属成员，PCV分为PCV1和PCV2两种基因型。PCV1无致病性，而PVC2是猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）的致病因子。该病毒在我国猪场中感染率高，猪群的平均阳性率一般都大于20%，有的甚至超过50%。已给规模化猪场造成了相当大的经济损失。对于该病的防制主要是依靠疫苗，目前商品化的PCV2疫苗有PCV2全病毒灭活疫苗、PCV1-PCV2嵌合病毒灭活疫苗以及杆状病毒表达Cap蛋白灭活疫苗，尽管这些疫苗被证明是可以有效的减少PCV2感染的死亡率，但由于制备过程繁琐，纯化难度大、成本高昂等原因，限制了大规模生产和普及推广。
类弹性蛋白多肽（ELP）是一种具有弹性功能且对外界环境异常敏感的人工合成的基因工程蛋白质聚合物。ELP在水溶液中具有良好的可溶性，其结构主要由五肽重复序列单元构成，即VPGXG，源自于类弹性蛋白的疏水性区域，其中X可以是除Pro以外的任何一种氨基酸。类弹性蛋白多肽有一个可逆的相变过程，此过程被定义为反转变温度相变（Inverse temperature transition，ITT），即若周围环境的温度低于该相变温度（transition temperature, Tt）时，ELP呈现高度可溶，结构为高度伸展的无序结构状态。相反，当周围环境温度高于该相变温度时，含水的多肽链结构就会瓦解并开始聚集，形成一个富含ELP的聚集物，此时为不可融状态。鉴于ELP的这种特殊性质，已经被广泛用于蛋白质的纯化和质粒DNA的分离技术。
目前市场上尚无用大肠埃希氏菌（Escherichia coli）（本发明以下称大肠杆菌）系统表达生产PCV-2亚单位疫苗的报道，主要原因是Cap基因不能在大肠杆菌中有效表达，但去掉核定位信号或优化密码子可以表达。本发明将ELP类弹性蛋白多肽编码序列与删除了核定位信号（前39个氨基酸）并优化成大肠杆菌偏爱密码子序列的Cap编码序列进行重组，在大肠杆菌系统中进行表达，以便融合蛋白高水平表达；用低温诱导融合蛋白表达，以便获得高度可溶且活性上佳的蛋白；在优化条件下进行ITC纯化，以便达到最高回收率和最高蛋白纯度。与现有重组猪圆环病毒疫苗纯化方式相比，用本发明的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的纯化方式不仅简单、经济，纯化的融合蛋白符合兽用生物制品的质量标准，可进一步研究用于重组亚单位疫苗的应用与生产。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的纯化方法。
本发明的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白，由ELP类弹性蛋白多肽与猪圆环病毒2型Cap蛋白组成。转入大肠杆菌系统表达证明，经人工优化后重组猪圆环病毒2型Cap蛋白能够高效表达。再经ITC纯化，能够分离出纯度理想的融合蛋白。
本发明的技术方案
1. 一种重组猪圆环病毒2型Cap蛋白，其特征在于，该重组猪圆环病毒2型Cap蛋白是由ELP类弹性蛋白多肽基因和PCV2-ORF2基因组成。
2. 权利要求1所述的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
（1）合成ELP类弹性蛋白多肽编码的序列SEQ ID No.1插入pET-30a载体，获得融合表达载体pET-ELP；
（2）合成无核定位信号并优化成大肠杆菌密码子的PCV-2 Cap编码序列SEQ ID No.2，插入pET-ELP载体，获得重组载体pELP-Cap；
（3）将重组载体转入BLR大肠杆菌，获得重组菌被命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）pELP-Cap（BLR）株，该株菌已于2016年10月？日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.？？？？？ ；将该株菌在20℃用IPTG诱导蛋白表达；
（4）在室温12000g离心破碎后的全菌，去沉淀取上清；
（5）向上清液中加入NaCl至终浓度为2M；
（6）在26℃、12000g离心沉淀蛋白；
（7）用4℃PBS重悬溶解沉淀的蛋白；
（8）在4℃、12000g离心重悬溶解的蛋白，去沉淀取上清。
3. 如权利2所述的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（1）是：ELP编码序列为人工优化的大肠杆菌偏爱密码子序列；步骤（2）是：PCV-2 Cap编码序列删除核定位信号前39个氨基酸，并人工优化成大肠杆菌密码子序列；步骤（3）是：在低温进行猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达；步骤（4）是：在适当盐离子和温度条件下，利用ELP相变循环的特性，对重组猪圆环病毒2型Cap蛋白进行纯化。
具体实施步骤
生物材料来源：
1. pET-30a载体：从美国Novagen公司购入，本公司实验室保存。
2. DH5a 大肠杆菌：从美国BD Biosciences Clontech 公司购入，本公司实验室保存。
3. BLR大肠杆菌：从美国Novagen 公司购入，本公司实验室保存。
具体操作步骤如下：
1. pET-ELP载体构建
（1）合成ELP类弹性蛋白多肽编码序列（SEQ ID No.1），5'端引入Nde I酶切位点, 3'端引入Sac I酶切位点，将序列送至南京金瑞斯生物科技有限公司合成，克隆在pUC57质粒载体中，SEQ ID No.1如所示：
5'-CATATGGGCCACGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGC 60
GCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGT 120
GGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGC 180
GTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGT 240
GTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGT 300
GGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGC 360
GCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGT 420
GGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGC 480
GTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGT 540
GTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGT 600
GGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGC 660
GCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGT 720
GGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGC 780
GTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGT 840
GTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGT 900
GGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGC 960
GCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGT 1020
GGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGC 1080
GTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGT 1140
GTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGT 1200
GGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGC 1260
GCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGT 1320
GGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGC 1380
GTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGT 1440
GTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGT 1500
GGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGC 1560
GCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGT 1620
GGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGGGCTGGTGAGCTC-3，1679
（2）用限制酶Nde I和Sac I消化pUC57-ELP载体，琼脂糖凝胶电泳分离后，用AXYGEN DNA凝胶回收试剂盒（康宁生物科学有限公司）回收ELP序列，与相同酶切的pET-30a载体连接，获得融合表达载体pET-ELP（图1）。
（3）将PCV2-Cap编码序列前39个氨基酸删除后，用JAVA Codon Adaption Tool（文献：Grote A, Hiller K, Scheer M, Münch RB, Hempel DC, Jahn D. JCat:a novel tool to adapt codon usage of a target gene to its potential expression host. Nucleic Acids Research, 2005，1:33）将优化成大肠杆菌偏爱密码子序列（SEQ ID No.2），5'端引入HindIII酶切位点, 3'端引入XhoI酶切位点，将序列送南京金瑞斯生物科技有限公司合成，克隆在pUC57载体中，获得pUC57-Cap载体。SEQ ID No.2如所示：
5'-TGTACACAACAACGGTATCTTCAACACCCGTCTGTCTCGTACCATCGGTTACACCGTTAA 60
AAAAACCACCGTTCGTACCCCGTCTTGGAACGTTGACATGATGCGTTTCAACATCAACGA 120
CTTCCTGCCGCCGGGTGGTGGTTCTAACCCGCTGACCGTTCCGTTCGAATACTACCGTAT 180
CCGTAAAGTTAAAGTTGAATTCTGGCCGTGCTCTCCGATCACCCAGGGTGACCGTGGTGT 240
TGGTTCTACCGCTGTTATCCTGGACGACAACTTCGTTACCAAAGCTAACGCTCTGACCTA 300
CGACCCGTACGTTAACTACTCTTCTCGTCACACCATCACCCAGCCGTTCTCTTACCACTC 360
TCGTTACTTCACCCCGAAACCGGTTCTGGACCGTACCATCGACTACTTCCAGCCGAACAA 420
CAAACGTAACCAGCTGTGGCTGCGTCTGCAGACCACCGGTAACGTTGACCACGTTGGTCT 480
GGGTACCGCTTTCGAAAACTCTATCTACGACCAGGACTACAACATCCGTATCACCATGTA 540
CGTTCAGTTCCGTGAATTCAACCTGAAAGACCCGCCGCTGAACCCGAAATAATCTAGA-3' 598。
（4）用限制酶HindIII和XhoI将Cap编码序列从pUC57-Cap载体切下，插入pET-ELP载体相应位点，获得重组载体pELP-Cap（图1）。
2. 重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达与纯化
（1）将重组质粒pELP-Cap转入BLR大肠杆菌，获得重组菌被命名为大肠杆菌pELP-Cap（BLR）株，该株菌已于2016年10月？日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.？？？？？ ；挑取重组菌的单菌落接种卡那霉素（50μg/ml）LB培养基，37°C、220r/min培养过夜；按1:100比例接种卡那霉素2×YT培养液（Tryptone 16g，Yeast Extract 10g，NaCl 5g，pH7.2），37°C、220r/min培养至OD600＝0.6，加入0.2mM IPTG，37°C诱导表达6h；4°C、5000g离心10min，沉淀菌体用PBS（NaCl 7.9g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，pH 7.4）悬浮，超声波充分裂解（200W，2s，停3s，20min）；4℃、12000g离心10min，取上清加入NaCl至终浓度分别为2M，分别在20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃水浴孵育5min，在各同样温度下12000g离心10min收集沉淀，PBS重悬后进行SDS-PAGE电泳分析。结果显示：重组菌pELP-Cap（BLR）能表达预期67kDa的融合蛋白，在26℃孵育后能获得最大回收率，达到92%（图2）。
（2）取裂解后菌体，4℃、12000g离心10min，取上清加入NaCl至终浓度分别为1、2、3M，在26℃水浴孵育5min，同样温度12000g离心10min收集沉淀，用4℃的PBS复溶沉淀，同样温度12000g离心10min去沉淀，取上清进行SDS-PAGE电泳分析。结果显示：在2M NaCl 回收率最佳，达到92%，纯度达到93%（图3）。
附图说明
图1 为pELP-Cap重组载体结构示意图。PT7为大肠杆菌T7启动子；ELP为类弹性蛋白多肽编码序列；Cap为猪圆环病毒2型Cap蛋白编码序列。
图2为纯化融合蛋白在不同盐离子浓度的SDS-PAGE分析。M为蛋白Marker；1为裂解重组菌全菌；2-4为裂解重组菌离心上清26℃分别与1M、2M 、3M NaCl作用后的离心沉淀。
图3为纯化融合蛋白在不同温度下的SDS-PAGE分析。M为蛋白Marker；1为裂解重组菌全菌；2～7为裂解菌体的离心上清在NaCl终浓度为2M时，分别在20、22、24、26、28、30℃下ITC结果。
本发明涉及生物材料资源信息
1. pET-30a载体：从美国Novagen 公司购入，本公司实验室保存。
2. DH5a 大肠杆菌：从美国BD Biosciences Clontech 公司购入，本公司实验室保存。
3. BLR大肠杆菌：从美国Novagen 公司购入，本公司实验室保存。
4. 大肠埃希氏菌（Escherichia coli）pELP-Cap株重组菌，简称大肠杆菌pELP-Cap（BLR）株，该株菌已于2016年10月？日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.？？？？？。
本发明的积极意义
本发明涉及一种重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的制备与纯化方法。所述的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白，由ELP类弹性蛋白多肽基因和PCV2-ORF2基因组成。其制备方法包括表达载体构建、融合蛋白表达与纯化。与现有的猪圆环病毒疫苗的纯化方法相比，本发明的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白纯化方法具有制备简单、易纯化和价格低廉等优点，适合进行大规模生产操作，为后续重组猪圆环病毒亚单位疫苗的制备、纯化和应用提供了基础。
实施例
本实施例为进一步说明本发明，不对本发明请求保护的技术方案构成限制。
实施例1
——重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的制备
生物材料来源：
1. pET-30a载体：从美国Novagen公司购入，本公司实验室保存。
2. DH5a 大肠杆菌：从美国BD Biosciences Clontech 公司购入，本公司实验室保存。
3. BLR大肠杆菌：从美国Novagen 公司购入，本公司实验室保存。
具体操作步骤如下：
1. pET-ELP载体构建
（1）合成ELP类弹性蛋白多肽编码序列（SEQ ID No.1），5'端引入Nde I酶切位点, 3'端引入Sac I酶切位点，将序列送至南京金瑞斯生物科技有限公司合成，克隆在pUC57质粒载体中，SEQ ID No.1如所示：
5'-CATATGGGCCACGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGC 60
GCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGT 120
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GGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGC 360
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GCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGT 720
GGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGC 780
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GGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGC 960
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GGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGC 1260
GCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGT 1320
GGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGC 1380
GTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGT 1440
GTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGT 1500
GGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGC 1560
GCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGT 1620
GGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGGGCTGGTGAGCTC-3，1679
（2）用限制酶Nde I和Sac I消化pUC57-ELP重组载体，琼脂糖凝胶电泳分离后，用AXYGEN DNA凝胶回收试剂盒（康宁生物科学有限公司）回收ELP序列，与相同酶切的pET-30a载体连接，获得融合表达载体pET-ELP（图1）。
（3）将PCV2-Cap编码序列前39个氨基酸删除后，用JAVA Codon Adaption Tool（文献：Grote A, Hiller K, Scheer M, Münch RB, Hempel DC, Jahn D. JCat:a novel tool to adapt codon usage of a target gene to its potential expression host. Nucleic Acids Research, 2005，1:33）将优化成大肠杆菌偏爱密码子序列（SEQ ID No.2），5'端引入HindIII酶切位点, 3'端引入XhoI酶切位点，将序列送南京金瑞斯生物科技有限公司合成，克隆在pUC57载体中，获得pUC57-Cap载体。SEQ ID No.2如所示：
5'-TGTACACAACAACGGTATCTTCAACACCCGTCTGTCTCGTACCATCGGTTACACCGTTAA 60
AAAAACCACCGTTCGTACCCCGTCTTGGAACGTTGACATGATGCGTTTCAACATCAACGA 120
CTTCCTGCCGCCGGGTGGTGGTTCTAACCCGCTGACCGTTCCGTTCGAATACTACCGTAT 180
CCGTAAAGTTAAAGTTGAATTCTGGCCGTGCTCTCCGATCACCCAGGGTGACCGTGGTGT 240
TGGTTCTACCGCTGTTATCCTGGACGACAACTTCGTTACCAAAGCTAACGCTCTGACCTA 300
CGACCCGTACGTTAACTACTCTTCTCGTCACACCATCACCCAGCCGTTCTCTTACCACTC 360
TCGTTACTTCACCCCGAAACCGGTTCTGGACCGTACCATCGACTACTTCCAGCCGAACAA 420
CAAACGTAACCAGCTGTGGCTGCGTCTGCAGACCACCGGTAACGTTGACCACGTTGGTCT 480
GGGTACCGCTTTCGAAAACTCTATCTACGACCAGGACTACAACATCCGTATCACCATGTA 540
CGTTCAGTTCCGTGAATTCAACCTGAAAGACCCGCCGCTGAACCCGAAATAATCTAGA-3' 598。
（4）用限制酶HindIII和XhoI将Cap编码序列从pUC57-Cap载体切下，插入pET-ELP载体相应位点，获得重组载体pELP-Cap（图1）。
2. 重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达与纯化
（1）将重组质粒pELP-Cap转入BLR大肠杆菌，获得重组菌被命名为大肠杆菌pELP-Cap（BLR），该株菌已于2016年10月？日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.？？？？？ ；挑取重组菌的单菌落接种卡那霉素（50μg/ml）LB培养基，37°C、220r/min培养过夜；按1:100比例接种卡那霉素2×YT培养液（Tryptone 16g，Yeast Extract 10g，NaCl 5g，pH7.2），37°C、220r/min培养至OD600＝0.6，加入0.2mM IPTG，37°C诱导表达6h；4°C、5000g离心10min，沉淀菌体用PBS（NaCl 7.9g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，pH 7.4）悬浮，超声波充分裂解（200W，2s，停3s，20min）；4℃、12000g离心10min，取上清加入NaCl至终浓度分别为2M，分别在20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃水浴孵育5min，在各同样温度下12000g离心10min收集沉淀，PBS重悬后进行SDS-PAGE电泳分析。结果显示：重组菌pELP-Cap（BLR）能表达预期67kDa的融合蛋白，在26℃孵育后能获得最大回收率，达到92%（图2）。
（2）取裂解后菌体，4℃、12000g离心10min，取上清加入NaCl至终浓度分别为1、2、3M，在26℃水浴孵育5min，同样温度12000g离心10min收集沉淀，用4℃的PBS复溶沉淀，同样温度12000g离心10min去沉淀，取上清进行SDS-PAGE电泳分析。结果显示：在2M NaCl 回收率最佳，达到92%，纯度达到93%（图3）。