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权利要求书

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利 要 求 书

1. 一种鸽副黏病毒毒价检测的方法,其特征在于该方法中运用了1%鸽红细胞进行测定鸽副黏病毒的血凝价。
2. 如权利要求1所述的一种鸽副黏病毒毒价检测的方法,其特征在于该方法中包括1% 鸽红细胞的制备过程。采集2~3只1~3月龄非免鸽(PM-HI效价≤1:4的美国王鸽)的血液,与抗凝剂混合(抗凝剂与血液的体积比为1:9),轻摇混匀。吸取10ml移至离心管中,以1500r/min离心10分钟,吸弃上清液及红细胞沉淀表面的白细胞层后,加入PBS缓冲液(0.1mol/L,pH 7.0~7.2,下同)至10ml,用吸管缓慢重悬后离心。重复3~4次,待上清液完全澄清。吸弃上清液,将沉积的红细胞用PBS配制成1%悬液。
3. 如权利要求1所述的一种鸽副黏病毒毒价检测的方法,其特征包括鸽副黏病毒ⅥbI4株血凝价的测定。在96孔微量板上第1到第12孔,每孔加入0.025mlPBS缓冲液,再用移液器吸取0.025ml ⅥbI4株鸽副黏病毒液加入第1孔中,吹吸10次混匀后吸取0.025ml加入第2孔中,依此作倍比稀释直至第11孔,吸弃0.025ml,第12孔作红细胞对照。每孔加入0.025ml 1%鸽红细胞悬液。振荡混匀后于室温静置15分钟后观察,以判定时1分钟内的读数为准。以使红细胞凝集被完全抑制的血清最高稀释度作为判定终点。
4. 如权利要求1所述的一种鸽副黏病毒毒价检测的方法,其特征包括鸽副黏病毒灭活疫苗免疫动物抗体的检测。
(1)血凝素血凝价的测定  采用96孔微量板法进行,具体操作参照表1。置96孔微量板在振荡器上摇匀,至室温15分钟,当对照孔中的红细胞呈显著纽扣状时判定结果,以判定时间控制在1分钟内结果为准。以使红细胞完全凝集的最高稀释度作为判定终点。
(2)血凝素工作液配制及检验  
4HAU血凝素的配制  按现行《中国兽药典》附录3404中方法进行。
检验  检查4HAU的血凝价是否准确,将配制的稀释液分别以1.0ml的量加入PBS 1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml和6.0ml中,使最终稀释度为1:2、1:3、1:4、1:5、1:6和1:7。然后,从每一稀释度中取0.025ml,加入PBS 0.025ml,再加入1%鸽红细胞悬液0.025ml,混匀。将血凝板置室温15分钟,如果配制的抗原液为4HAU,则1:4稀释度将给出凝集终点;如凝集终点未出现在1:4稀释度,应根据检验结果将血凝素稀释度做适当调整,使工作液确为4HAU。
(3)血凝抑制试验(HI)  按表2用PBS将免疫重组鸽副黏病毒灭活疫苗试验鸽的血清做2倍系列稀释,加入含4HAU的血凝素液,并设PBS和血凝素对照,充分振摇后,置室温下至少20分钟,再加入1%鸽红细胞悬液,置室温15分钟,当对照孔中的红细胞呈显著纽扣状时判定结果,以判定时1分钟内的读数为准。以使红细胞凝集被完全抑制的血清最高稀释度作为判定终点。
5. 如权利要求1所述的一种鸽副黏病毒毒价检测的方法,其特征包括鸽副黏病毒病毒含量的测定。将鸽副黏病毒ⅥbI4株毒液用PBS缓冲液作10倍系列稀释,取10-7、10-8、10-9 3个稀释度,各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚,每胚0.1ml,置36~37℃孵育,48小时以前死亡的鸡胚弃去不计,48~120小时内死亡的鸡胚随时取出,至120小时取出所有胚逐枚收获尿囊液,分别测其红细胞凝集价,HA效价不低于1:128者判为感染,按Reed-Muench法计算EID50。
6. 如权利要求1所述的一种鸽副黏病毒毒价检测的方法,其特征在于:
(1)所述抗凝剂为:氯化钠0.85g、柠檬酸三钠5g,溶于100ml超纯水,高压灭菌(116℃,20分钟),置于4℃冰箱保存备用。
(2)所述PBS缓冲液为:氯化钠8g、氯化钾0.2g,磷酸氢二钠2.9g,磷酸二氢钾0.24g,溶于1000ml超纯水,高压灭菌(116℃,20分钟),置于4℃冰箱保存备用。