权利要求书

权 利 要 求 书

1. 一种鸽副黏病毒毒价检测的方法，其特征在于该方法中运用了1%鸽红细胞进行测定鸽副黏病毒的血凝价。

2. 如权利要求1所述的一种鸽副黏病毒毒价检测的方法，其特征在于该方法中包括1% 鸽红细胞的制备过程。采集2~3只1~3月龄非免鸽（PM-HI效价≤1:4的美国王鸽）的血液，与抗凝剂混合（抗凝剂与血液的体积比为1:9），轻摇混匀。吸取10ml移至离心管中，以1500r/min离心10分钟，吸弃上清液及红细胞沉淀表面的白细胞层后，加入PBS缓冲液（0.1mol/L，pH 7.0~7.2，下同）至10ml，用吸管缓慢重悬后离心。重复3~4次，待上清液完全澄清。吸弃上清液，将沉积的红细胞用PBS配制成1%悬液。

3. 如权利要求1所述的一种鸽副黏病毒毒价检测的方法，其特征包括鸽副黏病毒ⅥbI4株血凝价的测定。在96孔微量板上第1到第12孔，每孔加入0.025mlPBS缓冲液，再用移液器吸取0.025ml ⅥbI4株鸽副黏病毒液加入第1孔中，吹吸10次混匀后吸取0.025ml加入第2孔中，依此作倍比稀释直至第11孔，吸弃0.025ml，第12孔作红细胞对照。每孔加入0.025ml 1%鸽红细胞悬液。振荡混匀后于室温静置15分钟后观察，以判定时1分钟内的读数为准。以使红细胞凝集被完全抑制的血清最高稀释度作为判定终点。

4. 如权利要求1所述的一种鸽副黏病毒毒价检测的方法，其特征包括鸽副黏病毒灭活疫苗免疫动物抗体的检测。

（1）血凝素血凝价的测定  采用96孔微量板法进行，具体操作参照表1。置96孔微量板在振荡器上摇匀，至室温15分钟，当对照孔中的红细胞呈显著纽扣状时判定结果，以判定时间控制在1分钟内结果为准。以使红细胞完全凝集的最高稀释度作为判定终点。

（2）血凝素工作液配制及检验  

4HAU血凝素的配制  按现行《中国兽药典》附录3404中方法进行。

检验  检查4HAU的血凝价是否准确，将配制的稀释液分别以1.0ml的量加入PBS 1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml和6.0ml中，使最终稀释度为1:2、1:3、1:4、1:5、1:6和1:7。然后，从每一稀释度中取0.025ml，加入PBS 0.025ml，再加入1%鸽红细胞悬液0.025ml，混匀。将血凝板置室温15分钟，如果配制的抗原液为4HAU，则1:4稀释度将给出凝集终点；如凝集终点未出现在1:4稀释度，应根据检验结果将血凝素稀释度做适当调整，使工作液确为4HAU。

（3）血凝抑制试验（HI）  按表2用PBS将免疫重组鸽副黏病毒灭活疫苗试验鸽的血清做2倍系列稀释，加入含4HAU的血凝素液，并设PBS和血凝素对照，充分振摇后，置室温下至少20分钟，再加入1%鸽红细胞悬液，置室温15分钟，当对照孔中的红细胞呈显著纽扣状时判定结果，以判定时1分钟内的读数为准。以使红细胞凝集被完全抑制的血清最高稀释度作为判定终点。

5. 如权利要求1所述的一种鸽副黏病毒毒价检测的方法，其特征包括鸽副黏病毒病毒含量的测定。将鸽副黏病毒ⅥbI4株毒液用PBS缓冲液作10倍系列稀释，取10-7、10-8、10-9 3个稀释度，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1ml，置36~37℃孵育，48小时以前死亡的鸡胚弃去不计，48~120小时内死亡的鸡胚随时取出，至120小时取出所有胚逐枚收获尿囊液，分别测其红细胞凝集价，HA效价不低于1:128者判为感染，按Reed-Muench法计算EID50。

6. 如权利要求1所述的一种鸽副黏病毒毒价检测的方法，其特征在于：

（1）所述抗凝剂为：氯化钠0.85g、柠檬酸三钠5g，溶于100ml超纯水，高压灭菌（116℃，20分钟），置于4℃冰箱保存备用。

（2）所述PBS缓冲液为：氯化钠8g、氯化钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，磷酸二氢钾0.24g，溶于1000ml超纯水，高压灭菌（116℃，20分钟），置于4℃冰箱保存备用。