说明书

说  明  书
 
一种鸽副黏病毒毒价的检测方法

技术领域
本发明涉及一种鸽副黏病毒毒价检测的方法，属于兽用生物制品领域。

背景技术
鸽副黏病毒病又称鸽新城疫，是由鸽副黏病毒Ⅰ型（pigeon paramyxovirus-1，PPMV-1）引起的流行于鸽群中的一种高度接触性传染病，临床症状同鸡新城疫相似。鸽副黏病毒和其他副黏病毒具有血凝性，可通过血凝试验判定毒价，通常是用鸡、豚鼠和人O型红血球。按照常规血凝试验方法进行鸽副黏病毒血凝价测定时，会出现测定结果不稳定，病毒对鸡红细胞凝集不完全导致观察较困难、重复性差等情况。

发明内容
本发明的目的在于建立了稳定的鸽副黏病毒毒价的检测方法。使用该方法后可将检测差异控制在一个滴度范围内，可客观、稳定的反映病毒的毒价及通过毒价测得的相关指标如病毒含量、免疫动物血清抗体水平等。
这可能与该病毒是鸽源病毒有关。我们采用鸽红细胞代替鸡红细胞进行试验，结果显示采用1%鸽红细胞进行血凝试验，测定毒价较高，鸽副黏病毒对鸽红细胞凝集性较强，凝集完全，结果判定时较易观察，测定结果较稳定，重复性好。因此测定鸽副黏病毒的毒价可用鸽红细胞进行。但鸽副黏病毒对鸽红细胞凝集后解凝较快，将试验条件如反应时间、红细胞静置时间等进行优化非常重要。为了实现上述目的，本发明采取了如下技术方案：
1. 一种鸽副黏病毒毒价的检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：（1）1%鸽红细胞悬液的配制；（2）血凝素血凝价的测定；（3）4HAU血凝素工作液配制及检验；（4）血凝抑制试验。  
2. 本发明所述一种鸽副黏病毒毒价的检测方法，其特征在于该方法中的1%鸽红细胞悬液的配制方法为；采集2~3只1~3月龄非免鸽（PM-HI效价≤1:4的美国王鸽）的血液，与抗凝剂混合（抗凝剂与血液的体积比为1:9），轻摇混匀。吸取10ml移至离心管中，以1500r/min离心10min，吸弃上清液及红细胞沉淀表面的白细胞层后，加入PBS缓冲液（0.1mol/L，pH 7.0~7.2，下同）至10ml，用吸管缓慢重悬后离心。重复3~4次，待上清液完全澄清。吸弃上清液，将沉积的红细胞用PBS配制成1%悬液。
3.本发明所述一种鸽副黏病毒毒价的检测方法，其特征在于该方法中的抗凝剂和PBS缓冲液的配制：
（1）抗凝剂的配制：氯化钠0.85g、柠檬酸三钠5g，溶于100ml超纯水，高压灭菌（116℃，20min），置于4℃冰箱保存备用。
（2）PBS缓冲液的配制：氯化钠8g、氯化钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，磷酸二氢钾0.24g，溶于1000ml超纯水，高压灭菌（116℃，20min），置于4℃冰箱保存备用。
4. 本发明所述一种鸽副黏病毒毒价的检测方法的应用，其特征在于该方法用于鸽副黏病毒培养液中病毒含量测定。
5. 本发明所述一种鸽副黏病毒毒价的检测方法的应用，其特征在于该方法用于疫苗免疫动物血清HI抗体的测定。
本发明具体实施方式
1.鸽副黏病毒毒价的检测方法：
（1）1%鸽红细胞悬液的配制  采集2~3只1~3月龄非免鸽（PM-HI效价≤1:4的美国王鸽）的血液，与抗凝剂混合（抗凝剂与血液的体积比为1:9），轻摇混匀。吸取10ml移至离心管中，以1500r/min离心10min，吸弃上清液及红细胞沉淀表面的白细胞层后，加入PBS缓冲液（0.1mol/L，pH 7.0~7.2，下同）至10ml，用吸管缓慢重悬后离心。重复3~4次，待上清液完全澄清。吸弃上清液，将沉积的红细胞用PBS配制成1%悬液。
（2）血凝素血凝价的测定  采用96孔微量板法进行，具体操作参照表1。置96孔微量板在振荡器上摇匀，至室温15min，当对照孔中的红细胞呈显著纽扣状时判定结果，以判定时间控制在1min内结果为准。以使红细胞完全凝集的最高稀释度作为判定终点。
表1  血凝素凝集价测定（96孔微量板法）术式

（3）血凝素工作液配制及检验  
4HAU血凝素的配制  按现行《中国兽药典》（中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部，中国农业出版社，2016，以下称《中国兽药典》）附录中方法进行。
检验  检查4HAU的血凝价是否准确，将配制的稀释液分别以1.0ml的量加入PBS 1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml和6.0ml中，使最终稀释度为1:2、1:3、1:4、1:5、1:6和1:7。然后，从每一稀释度中取0.025ml，加入PBS 0.025ml，再加入1%鸽红细胞悬液0.025ml，混匀。将血凝板置室温15min，如果配制的抗原液为4HAU，则1:4稀释度将给出凝集终点；如凝集终点未出现在1:4稀释度，应根据检验结果将血凝素稀释度做适当调整，使工作液确为4HAU。
（4）血凝抑制试验（HI）  按表2用PBS将免疫重组鸽副黏病毒灭活疫苗试验鸽的血清做2倍系列稀释，加入含4HAU的血凝素液，并设PBS和血凝素对照，充分振摇后，置室温下至少20min，再加入1%鸽红细胞悬液，置室温15min，当对照孔中的红细胞呈显著纽扣状时判定结果，以判定时1min内的读数为准。以使红细胞凝集被完全抑制的血清最高稀释度作为判定终点。
表2  血凝抑制试验（96孔微量板法）术式

2. 抗凝剂和PBS缓冲液的配制：
（1）抗凝剂的配制：氯化钠0.85g、柠檬酸三钠5g，溶于100ml超纯水，高压灭菌（116℃，20min），置于4℃冰箱保存备用。
（2）PBS缓冲液的配制：氯化钠8g、氯化钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，磷酸二氢钾0.24g，溶于1000ml超纯水，高压灭菌（116℃，20min），置于4℃冰箱保存备用。

本发明涉及的微生物资源信息
本发明涉及的微生物是重组鸽副黏病毒ⅥbI4株，该毒株是由扬州大学提供，其于2007年通过反向遗传系统重组、构建的，已送交中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心保藏号为CGMCCNo.6149。
本发明的有益效果
本发明涉及一种鸽副黏病毒毒价的检测方法。突破了鸽副黏病毒灭活疫苗效力评价血清学方法不稳定性的瓶颈，先制备出1%鸽红细胞悬液，利用其测定出血凝素的血凝价，利用本发明的方法可准确判定病毒液的毒价，利用在此基础上配制的四单位工作液检测的抗体值结果稳定，重复性好。说明本发明可稳定地反应病毒毒价及疫苗免疫后动物体内抗体水平，进而真实的反应疫苗的免疫效果。

实施例
以下实施例为进一步对本发明进行阐述，但这些实施例不构成对本发明的限制。
实施例1
——血凝价的测定
     （1）1%鸽红细胞悬液的制备
取40日龄未免疫美国王鸽3只，分别采血，分离血清，经检测PM-HI效价均为阴性。采集血液混合后与抗凝剂轻摇混匀（抗凝剂与血液的体积比为1:9）。吸取抗凝鸽血10ml移至15ml离心管中，以1500r/min离心10min，吸弃上清液及红细胞沉淀表面的白细胞层后，加入PBS缓冲液（0.1mol/L，pH 7.0~7.2，下同）至10ml，用吸管缓慢重悬后离心。重复3~4次，待上清液完全澄清。吸弃上清液，将红细胞沉淀与PBS缓冲液体积比为1:9的比例混合，用胶头滴管轻轻吹打，混匀，制成10%鸽红细胞悬液。另取已高压灭菌的西林瓶，按1:9的比例加入10%鸽红细胞悬液及PBS缓冲液，轻轻吹打，混匀，即得1%鸽红细胞悬液。
（2） 血凝试验
取3块96孔微量板按如下操作进行。
在96孔微量板上第1到第12孔，每孔加入0.025mlPBS缓冲液，再用移液器吸取0.025ml ⅥbI4株鸽副黏病毒液加入第1孔中，吹吸10次混匀后吸取0.025ml加入第2孔中，依此作倍比稀释直至第11孔，吸弃0.025ml，第12孔作红细胞对照。每孔加入0.025ml 1%鸽红细胞悬液。3块微量板振荡混匀后分别于室温静置10、15、20min后观察结果。结果显示静置10min时红细胞对照孔未完全沉积，不易观察；静置15min时红细胞对照孔完全沉积可进行观察，但观察时间超过1min后病毒凝集孔会有解凝现象，故需在1min内判读完毕；静置20min时病毒凝集孔已解凝，此时判读会影响结果。因此需在静置15min时观察，观察时间控制在1min内。重复3次，静置15min判定，测得的病毒血凝价均为1:256。
实施例2
——血清HI抗体的测定
（1）血凝素血凝价的测定
采用96孔微量板法进行，具体操作参照表1。置96孔微量板在振荡器上摇匀，至室温15min观察读数，以判定时间控制在1min内结果为准。以使红细胞完全凝集的最高稀释度作为判定终点。鸽副黏病毒ⅥbI4株血凝价为1:256。
（2）血凝素的配制及检验
按《中国兽药典》附录3404中方法配制4HAU工作液。取PBS缓冲液4.5ml，加入鸽副黏病毒ⅥbI4株0.5ml，作10倍稀释，取10倍稀释液1.0ml加入到63ml PBS缓冲液中，最终稀释浓度为1:64。将配制的稀释液分别以1.0ml的量加入PBS缓冲液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml和6.0ml中，使最终稀释度为1:2、1:3、1:4、1:5、1:6和1:7。然后，从每一稀释度中取0.025ml，加入PBS 0.025ml，再加入1%鸽红细胞悬液0.025ml，混匀。将血凝板置室温静置15min观察，结果1:4稀释度为凝集终点，说明配制的工作液为4HAU。
（3）血凝抑制试验
取经重组鸽副黏病毒灭活疫苗免疫后28日采血，分离的血清样品（免疫组10份，编号为01~10；对照组5份，编号为D1~D5）进行抗体测定。按表2用PBS缓冲液将每份血清做2倍系列稀释，加入含4HAU的血凝素液，并设PBS和血凝素对照，充分振摇后，置室温下反应25min，再加入1%鸽红细胞悬液，振荡后置室温静置15min，1min内完成判定。以使红细胞凝集被完全抑制的血清最高稀释度作为判定终点。按同样方法重复测定3次，测得的结果一致。经计算免疫组抗体效价几何平均值为5.8log2，对照组抗体效价平均值为0.8log2。具体详见表3。

表3  成品效力试验结果

实施例3
——病毒含量测定
将鸽副黏病毒ⅥbI4株毒液用PBS缓冲液作10倍系列稀释，取10-7、10-8、10-9 3个稀释度，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1ml，置36~37℃孵育，48小时以前死亡的鸡胚弃去不计，48~120小时内死亡的鸡胚随时取出，至120小时取出所有胚逐枚收获尿囊液，分别测其红细胞凝集价，HA效价不低于1∶128者判为感染，按Reed-Muench法计算EID50。鸽副黏病毒ⅥbI4株病毒含量为108.5EID50/0.1ml。各胚液重复3次测定，结果均一致。具体结果见表4。
表4  病毒含量测定结果