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权 利 要 求 书
1. 一种猪流行性腹泻病毒传代培养方法，其特征在于该方法中病毒接种传代细胞前，病毒和细胞均需要用含胰酶终浓度40~100µg/ml的营养液进行预处理。
2. 如权利要求1所述一种猪流行性腹泻病毒传代培养方法，其特征在于该方法中病毒和细胞的预处理为：
（1）病毒活化 将分离到的猪流行性腹泻病毒流行毒株回温至37℃，并加入含胰酶终浓度40~100µg/ml的营养液于37℃处理5~10min；
（2）细胞敏化 将生长优良的Vero细胞单层用PBS洗涤1~3次，再用浓度为0.02%的EDTA溶液清洗一次，最后用含胰酶终浓度40~100µg/ml的营养液加到细胞单层中在37℃处理5~10min。
3. 如权利要求1所述一种猪流行性腹泻病毒传代培养方法，其特征在于该方法还包括：
（1）接毒 取预处理活化好的种毒按终培养体系的10%接种到敏化完成的细胞单层；
（2）孵育 37℃孵育1～2小时，期间做轻微晃动1～2次以保证种毒液均匀分布到细胞单层；
（3）换液：孵育完成后弃去孵育液，添加pH值为7.0～7.4的维持液；
（4）收毒：种毒接种完成后定期观察CPE，待细胞单层80%左右出现CPE后收毒,分装于-80度保存。
4. 如权利要求1所述的一种猪腹泻病毒稳定传代的培养方法，其特征在于：
（1）所述营养液为：含有40~100µg/ml的a-MEM培养基；
（2）所述维持液的成份为（V/V）：磷酸胰蛋白䏡肉汤（Tryptose phosphate broth，TPB）0.1%~1%，酵母提取液（Yeast extract） 0.001%~0.003%，胰酶（Trypsin）5~20µg/ml，二甲基亚砜（DMSO）0.1%～0.5%，胎牛血清0.5%～1%， EDTA 0.001%，双抗1%，a-MEM 89.0%～96.9%。
5. 如权利要求1所述的一种猪腹泻病毒稳定传代的培养方法，其特征在于该方法还包括对PEDV初步鉴定使用的ZC法，即：该方法还包括提取病毒RNA，反转录作为PCR的扩增模板，sF与sR作为扩增引物，扩增程序为：94℃预变性4min ；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，30个循环，最后72℃延伸10min，扩增的片段大小为640bp；其中检测引物通过分析GenBank中PEDV S基因的保守区域后设计：
sF:5'–CTACAGACGGATGTTCTACAGCGGA-3'（序列1）
sR:5' – CCGTCGCAGTATCTTGAAGTTCGTG - 3' （序列2）。
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