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权利要求书

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  利 要 求 书

1. 一种猪流行性腹泻病毒传代培养方法,其特征在于该方法中病毒接种传代细胞前,病毒和细胞均需要用含胰酶终浓度40~100µg/ml的营养液进行预处理。
2. 如权利要求1所述一种猪流行性腹泻病毒传代培养方法,其特征在于该方法中病毒和细胞的预处理为:
(1)病毒活化 将分离到的猪流行性腹泻病毒流行毒株回温至37℃,并加入含胰酶终浓度40~100µg/ml的营养液于37℃处理5~10min;
(2)细胞敏化 将生长优良的Vero细胞单层用PBS洗涤1~3次,再用浓度为0.02%的EDTA溶液清洗一次,最后用含胰酶终浓度40~100µg/ml的营养液加到细胞单层中在37℃处理5~10min。
3. 如权利要求1所述一种猪流行性腹泻病毒传代培养方法,其特征在于该方法还包括:
(1)接毒  取预处理活化好的种毒按终培养体系的10%接种到敏化完成的细胞单层;
(2)孵育  37℃孵育1~2小时,期间做轻微晃动1~2次以保证种毒液均匀分布到细胞单层;
(3)换液:孵育完成后弃去孵育液,添加pH值为7.0~7.4的维持液;
(4)收毒:种毒接种完成后定期观察CPE,待细胞单层80%左右出现CPE后收毒,分装于-80度保存。
4. 如权利要求1所述的一种猪腹泻病毒稳定传代的培养方法,其特征在于:
(1)所述营养液为:含有40~100µg/ml的a-MEM培养基;
(2)所述维持液的成份为(V/V):磷酸胰蛋白䏡肉汤(Tryptose phosphate broth,TPB)0.1%~1%,酵母提取液(Yeast extract) 0.001%~0.003%,胰酶(Trypsin)5~20µg/ml,二甲基亚砜(DMSO)0.1%~0.5%,胎牛血清0.5%~1%, EDTA 0.001%,双抗1%,a-MEM 89.0%~96.9%。
5. 如权利要求1所述的一种猪腹泻病毒稳定传代的培养方法,其特征在于该方法还包括对PEDV初步鉴定使用的ZC法,即:该方法还包括提取病毒RNA,反转录作为PCR的扩增模板,sF与sR作为扩增引物,扩增程序为:94℃预变性4min ;94℃ 30s,60℃ 30s,72℃ 30s,30个循环,最后72℃延伸10min,扩增的片段大小为640bp;其中检测引物通过分析GenBank中PEDV S基因的保守区域后设计:
sF:5'–CTACAGACGGATGTTCTACAGCGGA-3'(序列1)
sR:5' – CCGTCGCAGTATCTTGAAGTTCGTG - 3' (序列2)。