说明书

说  明  书

一种猪流行性腹泻病毒稳定传代的培养方法

 

技术领域

本发明涉及一种猪流行性腹泻病毒稳定培养传代的方法，属于生物培养领域。

 

背景技术

猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）于1978年在英国和比利时首次被报道后，中国、加拿大、匈牙利、日本、德国等多个国家相继报道了PED的发生，目前PED已成为危害世界养猪业的主要流行性疾病之一，给养猪业带来严重的经济损失。各国研究人员尝试用不同的方法使PEDV适应于细胞，以期将其分离培养，稳定传代，以便更好地研究其功能和制备疫苗。1988年，Hofmann等首次在Vero细胞上成功繁殖出PEDV，并发现胰酶是 PEDV 在 Vero 细胞中生长繁殖所必需的。此后Vero细胞系成为分离培养PEDV的首选细胞。中国学者也在Vero细胞上成功对个别PEDV毒株进行了分离传代，但毒株间的差异及培养条件对于PEDV的分离培养影响非常大，经常出现分离不到病毒或连续传代后病毒丢失的现象。这严重影响了流行野毒株的分离，尤其是毒株不能稳定传代 ，直接阻碍了流行强毒株的传代致弱，也影响了该病疫苗的研究进展。

 

发明内容

本发明的目的在于突破了猪流行性腹泻病毒在Vero细胞中稳定传代的瓶颈，提供了一种猪流行性腹泻病毒稳定传代的培养方法。使用该方法获得的PEDV在Vero细胞中能够稳定传代，可传至130代以上病毒不丢失，TCID50达108.0/ml以上，对于研发猪流行性腹泻病毒的新流行毒株疫苗是一个重大的突破。

 

为了实现上述目的，本发明采取了如下技术方案：

1. 一种猪流行性腹泻病毒传代培养方法，在于该方法中病毒接种传代细胞前，病毒和细胞均需要在含胰酶终浓度40~100µg/ml的营养液中进行预处理。

2. 本发明所述一种猪流行性腹泻病毒传代培养方法，在于该方法中病毒和细胞的预处理为：

（1）病毒活化 将分离到的猪流行性腹泻病毒流行毒株回温至37℃，并加入含胰酶终浓度40~100µg/ml的营养液于37℃处理5~10min；

（2）细胞敏化 将生长优良的Vero细胞单层用PBS洗涤1~3次，再用浓度为0.02%的EDTA溶液清洗一次，最后用含胰酶终浓度40~100µg/ml的营养液加到细胞单层中在37℃处理5~10min。

3. 本发明所述一种猪流行性腹泻病毒传代培养方法，还包括：

（1）接毒  取预处理活化好的种毒按终培养体系的10%接种到敏化完成的细胞单层；

（2）孵育  37℃孵育1～2小时，期间做轻微晃动1～2次以保证种毒液均匀分布到细胞单层；

（3）换液：孵育完成后弃去孵育液，添加pH值为7.0～7.4的维持液；

（4）收毒：种毒接种完成后定期观察CPE，待细胞单层80%左右出现CPE后收毒,分装于-80度保存。

4. 本发明所述的一种猪腹泻病毒稳定传代的培养方法，在于：

（1）所述营养液为：含有40~100µg/ml的a-MEM培养基；

（2）所述维持液的成份为（V/V）：磷酸胰蛋白䏡肉汤（Tryptose phosphate broth，TPB）0.1%~1%，酵母提取液（Yeast extract） 0.001%~0.003%，胰酶（Trypsin）5~20µg/ml，二甲基亚砜（DMSO）0.1%～0.5%，胎牛血清0.5%～1%， EDTA 0.001%，双抗1%， a-MEM 89.0%～96.9%。

5. 本发明所述一种猪流行性腹泻病毒传代培养方法，在于该方法还包括对PEDV初步鉴定使用的ZC法，即：该方法还包括提取病毒RNA，反转录作为PCR的扩增模板，sF与sR作为扩增引物，扩增程序为：94℃预变性 4 min ；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环，最后72℃延伸10min，扩增的片段大小为640bp；其中检测引物通过分析GenBank中PEDV S基因的保守区域后设计：

sF:5'–CTACAGACGGATGTTCTACAGCGGA-3'（序列1）

sR:5' – CCGTCGCAGTATCTTGAAGTTCGTG - 3' （序列2）。

 

本发明具体实施方式

1. 病毒培养

采用Vero细胞作为传代细胞，PEDV作为毒种，采用含有磷酸胰蛋白䏡肉汤、酵母提取液、DMSO、胰酶、双抗的a-MEM作为培养液，采用5%CO2的37℃恒温培养箱为孵育设备，并包括如下步骤：

（1）细胞培养

将生长优良的Vero细胞单层用PBS洗涤1~3次，用含胰酶终浓度40~100ug/ml的营养液于37℃处理5~10min，敏化细胞单层；

（2）活化病毒

将PEDV流行毒株回温至37℃，并加入用含胰酶终浓度40~100µg/ml的营养液活化5~10min；

（3）接毒 

取预处理活化好的种毒按终培养体系的10%接种到敏化完成的细胞单层；

（4）孵育

接毒后37℃ 5%CO2培养箱中孵育1~2小时，期间做轻微晃动1~2次以保证种毒液均匀分布到细胞单层；

（5）换液

孵育完成后弃去孵育液，添加pH值为7.0~7.4的维持液；

（6）收毒

种毒接种完成后定期观察CPE,待到细胞单层80%左右出现CPE后收毒（72小时左右）。分装于-80度保存；

2. 病毒培养物的鉴定

使用RT-PCR进行初步鉴定，通过分析GenBank中PEDV  S基因的保守区域后设计检测引物即：

是提取病毒RNA，反转录作为PCR的扩增模板，设计一对sF与sR作为扩增引物：

sF:5'– CTACAGACGG ATGTTCTACA GCGGA-3'    25（序列1）

sR:5' – CCGTCGCAGT ATCTTGAAGT TCGTG - 3'   25（序列2）

扩增程序为：94 ℃预变性4 min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，30个循环，最后72℃延伸10 min，能扩增出片段大小为640bp的特异性条带，为叙述方便，本发明称此方法为ZC法。

本发明所述营养液成份为含有终浓度40~100µg/ml胰酶的a-MEM培养基

本发明所述维持液成份为（V/V）：磷酸胰蛋白䏡肉汤（Tryptose phosphate broth，TPB）0.1~1%（上海瑞楚生物科技有限公司，20150803），酵母提取液（Yeast extract） 0.001%~0.003%（Qxoid，1275118-02），胰酶（Trypsin）5~20ug/ml（Gibco，1665845），二甲基亚砜（DMSO）0.1~0.5%（Sunshine（生兴生物），4J094J09），胎牛血清0.5~1%（Gibco，1624110），EDTA 0.001%（Gibco，AM9260G），双抗1%（Hyclone，J140016）， a-MEM 89.0~96.9%（Hyclone，NAA1323）；

本发明所述双抗为含10000IU/ml的青霉素和10000µg/ml的链霉素（Hyclone，J140016）

本发明所述PBS缓冲液的成份与含量为：NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L；KH2PO4 0.24g/L；Na2HPO4•12H2O 3.65g/L，pH为7.2~7.4。

 

本发明涉及的微生物资源信息

本发明涉及的微生物是猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）流行毒株ZC株 该毒株是本发明人分离自江苏泰州某发病猪场，该毒株于2016年04月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号为CGMCC No. 12260。

 

附图说明

图1  本发明的部份代次PCR结果  图1中：1、6  marker-DL2000，2. PEDV P10代  3. PEDV P50代，4. PEDV P100代  5. PEDV P130代。 

图2  本发明的部份代次PCR结果  图2中：1. PEDV P3代，2.PEDV P30代，3.PEDV P123代 ，4.PEDV P150代，5.marker-DL2000。

 

本发明的有益效果

本发明涉及一种猪流行性腹泻病毒稳定传代的培养方法。本发明突破了PEDV难以稳定传代的瓶颈，先使用低浓度胰酶敏化细胞与猪流行性腹泻病毒，然后再用含低浓度胰酶、磷酸胰蛋白䏡肉汤、酵母提取液、二甲基亚砜、EDTA、双抗的a-MEM培养基进行培养传代，PEDV可以获得稳定传代，传至130代以上病毒不丢失（图1和图2），TCID50达108.0/ml以上；同时使用RT-PCR对PEDV进行初步鉴定，大大缩短检测周期，这对于分离PEDV野毒、传代致弱及初步鉴定提供了重要的技术支撑。

 

实施例

以下实施例为进一步对本发明进行阐述，但这些实施例不构成对本发明的限制。

实施例1

——猪流行性腹泻病毒的培养，

1. 将生长优良的Vero细胞（扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室惠赠）单层用PBS洗涤3次，再用浓度为0.02%的EDTA溶液清洗一次，最后用含胰酶终浓度60µg/ml的营养液于37℃处理10min，敏化细胞单层；

2. 将ZC株（中崇信诺生物科技泰州有限公司分离于江苏泰州某发病猪场，命名为ZC株）回温至室温，并加入胰酶终浓度60µg/ml的a-MEM营养液于37℃活化10min；

3. 取上述活化好的毒株按终培养体系的10%接种到敏化完成的细胞单层；

    4. 孵育：37℃孵育1小时，期间做轻微晃动2次以保证种毒液均匀分布到细胞单层；

5. 换液：孵育完成后弃去孵育液，添加pH值为7.2的维持液；

6. 收毒：病毒接种完成后定期观察CPE，待到细胞单层80%左右出现CPE后收毒（72小时左右）。分装于-80度保存；

实施例2

——收获的病毒鉴定；

（1）TCID50的检测

取细胞毒液，用含20µg/ml 胰酶的MEM培养液将病毒作10倍系列稀释10-5、 10-6、10-7三个滴度分别接种于每孔含100µl Vero细胞液的96孔培养板的4个孔内，每孔100ul，同时设不接毒的细胞对照孔，置37℃ 、5% CO2培养箱，培养3天，观察细胞病变，计算TCID50。猪流行性腹泻病毒含量为108.0TCID50/ml。

（2）ZC法检测

用RNA提取试剂盒（TaKaRa，AK704）提取病毒RNA，一步法RT-PCR试剂盒（TaKaRa，AK3601）进行鉴定，引物为sF和sR扩增目的片段，扩增程序为：94 ℃预变性4 min ；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，30个循环，最后72℃ 延伸10min。扩增的片段大小为640bp（图2）。

实施例3

——连续传代试验

用上述方法连续传代，从P1代稳定传至P150代，部分代次PCR结果如图2。

本发明的技术方案中，所述维持液成份为（V/V）: 磷酸胰蛋白䏡肉汤（Tryptose phosphate broth，TPB）0.1%，酵母提取液（Yeast extract） 0.003%，胰酶（Trypsin）20ug/ml，二甲基亚砜（DMSO）0.1%，胎牛血清1%， EDTA0.001%、双抗1%，a-MEM 95.9。；

本发明的技术方案中，所述双抗为含10000IU/ml的青霉素和10mg/ml的链霉素溶液。

本发明的技术方案中，所述PBS缓冲液的成份与含量为：NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L；KH2PO4 0.24g/L；Na2HPO4•12H2O 3.65g/L，pH为7.2~7.4。

 

在本说明书中的“实施例，指的是结合该实施例描述具体特征、结构或者特点。进一步来说，结合任一实例描述一个具体特征、结构或者特点时，所要主张的是结合其他实例来实现这种特征、结构或者特点也落在本发明的范围内。

尽管这里参照本发明的实例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本申请公开和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。

 

序列表

 

<110>  中崇信诺生物科技泰州有限公司

<120>  一种猪流行性腹泻病毒稳定传代的培养方法

<130>

<160>  2

<170>  Patentin version 3.5

 

<210>  1

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

<223> 对人工序列的描述：引物sF 

<400>  1

CTACAGACGG ATGTTCTACA GCGGA    25

 

<210>  2

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

<223> 对人工序列的描述：引物sR 

<400>  1

 CCGTCGCAGT ATCTTGAAGT TCGTG    25