江苏省泰州市医药高新区陶弘景路3号

4000627770

0523-86867577

xnkj@xnswkj.cn

公司简介产品中心

新闻动态技术中心

快捷导航 >

ABOUT US

关于我们

公司专利

Cerfication & Honor

说明书

浏览量

说明书

一种用于动物用灭活疫苗的乳化方法

技术领域

本发明涉及一种用于动物用灭活疫苗的乳化方法，属于动物生物制品领域。

背景技术

新城疫、传染性支气管炎和禽流感H9亚型三种疾病近年来的爆发，成为危害养鸡业健康发展的三大重要传染病，每年给养禽业都造成了巨大的经济损失。而疫苗是这三大疫病最重要有效的防控手段。新城疫A-VII株和禽流感WJ57株是现流行毒株的代表株，传染性支气管炎M41是经典疫苗株，相应单苗、联苗及三联苗的面世，对于三大疫病的防控都将具有积极的社会与经济意义。

但在灭活疫苗的制备过程当中，乳化工序中乳化剂的选择、配方和乳化方式不合适，均可导致灭活疫苗剂型不稳定，不仅影响外观及临床应用效果，严重的会破乳，产生不可逆的性状改变，导致疫苗无法使用。

乳化完成后，按照中国兽药典的方法：取10ml疫苗，以3000r/min离心15min，不分层为合格。刚乳化完成的悬乳液，用此法检测时极少会出现分层或破乳，但在2～8℃保存7～30天左右会出现分层现象。

为解决乳化后保存在2～8℃条件下疫苗分层的现象，本发明拟用新的乳化剂配方和乳化方式，合适的亲水亲油值，在低温状态下进行乳化，制备出稳定、均匀、安全和高效的预防新城疫、传染性支气管炎和禽流感（H9亚型）相关灭活疫苗。

发明内容

本发明的目的在于突破乳化后易分层的问题，提供一种用于动物用灭活疫苗的乳化方法。该方法可以制备出稳定、均匀、安全和高效的动物用灭活疫苗。使其粒径D90小于等于1.0，黏度值为10~100 cP，且在2～8℃条件下，保存24个月不分层，效力检验合格。对于新城疫（A-VII株）、禽流感（WJ57株）、传染性支气管炎（M41株）灭活疫苗及相应联苗的大规模生产中的重要环节乳化来说，是个非常大的改进和突破。

为了实现上述指标，本发明采取了如下技术方案：

一种用于动物用灭活疫苗的乳化方法，该方法包括如下步骤：

（1）新城疫病毒A-VII株：毒种用无菌PBS做适当稀释，尿囊腔接种9～11日龄低免鸡胚，每胚103.0～106.0EID50/0.1ml。选接种后48～96小时死亡的鸡胚，置2～8℃冷却12～24小时，收获鸡胚液于专业灭菌容器中，每0.1ml病毒液的病毒含量≥108.5EID50，备用；

传染性支气管炎病毒M41株：毒种用无菌PBS做适当稀释，尿囊腔接种9~11日龄低免鸡胚，每胚102.0～104.0EID50/0.1ml。选接种后24～48小时死亡的鸡胚，置2～8℃冷却12～24小时，收获鸡胚液于专业灭菌容器中，每0.1ml病毒液的病毒含量≥106.5EID50，备用；

禽流感H9亚型病毒WJ57株：毒种用无菌PBS做适当稀释，尿囊腔接种9～11日龄低免鸡胚，每胚103.0～106.0EID50/0.1ml。选接种后48~72小时后的鸡胚，置2～8℃冷却12～24小时，收获鸡胚液于专业灭菌容器中，每0.1ml病毒液的病毒含量≥108.5EID50，备用；

（2）将上述收获的新城疫病毒抗原、传染性支气管炎病毒抗原和禽流感H9亚型病毒抗原以一定的比例混合成水相，加入浓度为0.1%～0.25%的甲醛，于37℃，1000～2000r/min搅拌，灭活16~24小时；

（3）灭活完成后，加入甘氨酸和硫柳汞，混匀成水相；

（4）将白油，吐温-80和司本-80按一定比例混合成油相，无菌过滤；

（5）乳化容器放置于冰浴中，在容器中加入油相3份，2000r/min剪切搅拌，在剪切过程中缓慢加入1份水相，当水相加完后，搅拌剪切的速度调整至5000~9000r/min，搅拌5~10min；

（8）乳化完成后，测定粒径和黏度；

（9）在2～8℃保存24个月后，所制备的三联灭活疫苗未发现分层，效力检验合格。

2. 权利要求1所述一种用于动物用灭活疫苗的乳化方法，其特征在于该方法用于制备单一抗原成分的灭活疫苗和两种抗原成分的二联灭活疫苗。

具体实施方式

本发明采用低免胚作为制备抗原的鸡胚，新城疫病毒A-VII株、传染性支气管炎病毒M41株、禽流感H9亚型病毒WJ57株作为种毒，分别制备抗原，将三种抗原以1:1:1的比例混合后灭活，在抗原混合液中加入甘氨酸和硫柳汞作为水相，不同比例的白油、吐温-80和司本-80混匀后过滤除菌，作为油相，3份油相与1份水相在冰浴条件下进行剪切乳化，并包括如下步骤：

（1）抗原制备

新城疫病毒A-VII株：毒种用无菌PBS做适当稀释，尿囊腔接种9～11日龄低免鸡胚，每胚103.0～106.0EID50/0.1ml。选接种后48～96小时死亡的鸡胚，置2～8℃冷却12～24小时，收获鸡胚液于专业灭菌容器中，每0.1ml病毒液的病毒含量≥108.5EID50，备用；

禽流感H9亚型病毒WJ57株：毒种用无菌PBS做适当稀释，尿囊腔接种9~11日龄低免鸡胚，每胚103.0～106.0EID50/0.1ml。选接种后48~72小时后的鸡胚，置2～8℃冷却12～24小时，收获鸡胚液于专业灭菌容器中，每0.1ml病毒液的病毒含量≥108.5EID50，备用；

（2）灭活将上述收获的新城疫病毒抗原、传染性支气管炎病毒抗原和禽流感H9亚型病毒抗原以一定的比例混合成水相，加入浓度为0.1%~0.25%的甲醛，于37℃，1000～2000r/m搅拌，灭活16~24小时；

（3）水相灭活完成后，加入甘氨酸和硫柳汞，混匀成水相；

（4）油相将白油，吐温-80和司本-80按一定比例混合成油相，无菌过滤；

（5）乳化乳化容器放置于冰浴中，在容器中加入油相3份，2000r/min剪切搅拌，在剪切过程中缓慢加入1份水相，当水相加完后，搅拌剪切的速度调整至5000~9000r/min，搅拌5~10min；

（8）测定乳化完成后，测定粒径和黏度；

（9）保存期在2-8℃保存24个月后，所制备的三联灭活疫苗未发现分层，效力检验合格；

本发明所述新城疫病毒毒株为A-VII株，传染性支气管炎毒株为M41株，禽流感病毒毒株为WJ57株；

本发明所述甘氨酸浓度为0.1%~1.0%，硫柳汞的浓度为0.1%~1.0%。

本发明所述油相中白油含量为70%~85%，吐温-80含量为12.5%~20%，司本-80的含量为2.5%~10%；

本发明所述油相与水相比例为3:1，亲水亲油值为6.7~7.6之间；

本发明所述乳化后的均匀乳液粒径D90小于等于1.0，黏度值为10~100 cP。

附图说明

图1 本发明乳化后疫苗测定的D90为0.46 μm。

图2 疫苗性状（2-a：常规乳化工序；2-b：本发明乳化工序）。图中显示：2～8℃保存24个月的检验结果所制备的三联灭活疫苗未发现分层（图2b）、效力检验合格。

本发明所涉及的生物材料资源信息

本发明所述新城疫病毒（Newcastile disease virus）基因 VII 型新城疫病毒致弱株 A-NDV-VII （CGMCC NO.2141），本发明称：A-VII株，购自扬州大学，（参见：中国专利：ZL200710131863，基因Ⅶ型新城疫病毒致弱株 A-NDV-Ⅶ及其构建方法）；传染性支气管炎病毒（Infection bronchitis virus）毒株为M41株购自中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC AV1511株，请见中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录，第二版，2002年，中国农业科学技术出版社，p136）；禽流感病毒（Avian influenza virus）毒株为A/Chicken/Jiangsu/WJ57/2012[WJ/57（H9N2）]株，本发明简称为WJ57株，购自扬州大学，该毒株是扬州大学2012年2月由我国江苏禽流感患病鸡分离到（参见X.Hao et al, Reassortant H5N1 avian influenza viruses containing PA or NP gene from an H9N2 virus significantly incrase the pathogicity in mice. Veterinary Microbiologyn 192(2016)95-101.）。

本发明的有益效果

本发明涉及一种用于动物用灭活疫苗的乳化方法。本发明技术突破了乳化后按国家标准检测无分层，但放置于2～8℃保存时易分层的瓶颈，先分别以低免胚制备三种抗原，混匀三种抗原后灭活，并加入甘氨酸和硫柳汞作为水相，不同比例的白油、吐温-80和司本-80混匀后过滤除菌作为油相，水相油相经低温剪切乳化后，粒径D90小于等于1.0，黏度值为10～100 cP，2～8℃保存24个月后，所制备的三联灭活疫苗未发现分层，效力检验合格。说明本发明可以制备出稳定、均一、安全、高效的新城疫、传染性支气管炎和禽流感H9亚型三联灭活疫苗。

实施例

以下实施例为进一步对本发明进行阐述，但这些实施例不构成对本发明的限制。

实施例1

——新城疫-传染性支气管炎-禽流感H9亚型三联灭活疫苗的制备，包括如下步骤：

（1）抗原制备

新城疫病毒毒种用无菌PBS做适当稀释，尿囊腔接种11日龄低免鸡胚，每胚104.0EID50/0.1ml。选接种后96小时死亡的鸡胚，置2～8℃冷却12小时，收获鸡胚液于专业灭菌容器中，病毒含量为108.5EID50/0.1ml，备用；

传染性支气管炎病毒毒种用无菌PBS做适当稀释，尿囊腔接种11日龄低免鸡胚，每胚104.0EID50/0.1ml。选接种后40小时死亡的鸡胚，置2～8℃冷却12小时，收获鸡胚液于专业灭菌容器中，病毒含量106.5EID50/0.1ml，备用；

禽流感H9亚型病毒毒种用无菌PBS做适当稀释，尿囊腔接种11日龄低免鸡胚，每胚104.0EID50/0.1ml。选接种后72小时后的鸡胚，置2～8℃冷却12小时，收获鸡胚液于专业灭菌容器中，病毒含量108.5EID50/0.1ml，备用；

（2）灭活将上述收获的新城疫病毒抗原、传染性支气管炎病毒抗原和禽流感H9亚型病毒抗原以（V/V）1:1:1混后，加入终浓度为0.1%的甲醛，于37℃，2000r/min搅拌，灭活16~24小时；

（3）水相灭活完成后，加入甘氨酸和硫柳汞，混匀成水相；

（4）油相将白油，吐温-80和司本-80按一定比例混合成油相，无菌过滤；

（5）乳化乳化容器放置于冰浴中，在容器中加入油相3份，2000r/min剪切搅拌，在剪切过程中缓慢加入1份水相，当水相加完后，搅拌剪切的速度调整至8000r/min，搅拌8min；

（8）测定乳化完成后，测定粒径和黏度；

（9）分装。

上述实施例中所述新城疫病毒毒株为A-VII株，传染性支气管炎毒株为M41株，禽流感病毒毒株为WJ57株；

上述技术方案所述甘氨酸终浓度为1.0%，硫柳汞的终浓度为0.1%；

上述技术方案所述油相中（V/V）白油含量为85%，吐温-80含量为12.5%，司本-80的含量为2.5%；

上述技术方案所述油相与水相（V/V）为3:1，亲水亲油值为6.84；

上述技术方案所述乳化后的均匀乳液粒径D90为0.46μm，黏度值为29.4cP。

实施例2

——新城疫灭活疫苗的制备

（1）抗原制备将新城疫病毒A-VII株毒种用无菌PBS做适当稀释，尿囊腔接种11日龄低免鸡胚，每胚104.0EID50/0.1ml。选接种后96小时死亡的鸡胚，置2～8℃冷却12小时，收获鸡胚液于专业灭菌容器中，病毒含量为108.5EID50/0.1ml，备用；

（2）灭活将上述收获的新城疫病毒抗原加入浓度为0.1%的甲醛，于37℃， 2000r/min搅拌，灭活16~24小时；

（3）水相灭活完成后，加入甘氨酸和硫柳汞，混匀成水相；

（4）油相将白油，吐温-80和司本-80按一定比例混合成油相，无菌过滤；

（8）测定乳化完成后，测定粒径和黏度；

（9）分装。

实施例3

——传染性支气管炎灭活疫苗的制备

抗原制备将传染性支气管炎病毒M41株：毒种用无菌PBS做适当稀释，尿囊腔接种11日龄低免鸡胚，每胚104.0EID50/0.1ml。选接种后40小时死亡的鸡胚，置2～8℃冷却12小时，收获鸡胚液于专业灭菌容器中，病毒含量106.5EID50/0.1ml，备用；

以下灭活、水相制备、油相制备、乳化、测定粒径和黏度和分装各工序同实施例2。

实施例4

——禽流感H9亚型灭活疫苗的制备

禽流感H9亚型病毒WJ57株：毒种用无菌PBS做适当稀释，尿囊腔接种11日龄低免鸡胚，每胚104.0EID50/0.1ml。选接种后72小时后的鸡胚，置2～8℃冷却12小时，收获鸡胚液于专业灭菌容器中，病毒含量108.5EID50/0.1ml，备用；

以下灭活、水相制备、油相制备、乳化、测定粒径和黏度和分装各工序同实施例2。

实施例5

——新城疫-传染性支气管炎二联灭活疫苗的制备

（1）抗原制备

将新城疫病毒A-VII株：毒种用无菌PBS做适当稀释，尿囊腔接种11日龄低免鸡胚，每胚104.0EID50/0.1ml。选接种后96小时死亡的鸡胚，置2～8℃冷却12小时，收获鸡胚液于专业灭菌容器中，病毒含量为108.5EID50/0.1ml，备用；

将传染性支气管炎病毒M41株：毒种用无菌PBS做适当稀释，尿囊腔接种11日龄低免鸡胚，每胚104.0EID50/0.1ml。选接种后40小时死亡的鸡胚，置2～8℃冷却12小时，收获鸡胚液于专业灭菌容器中，病毒含量106.5EID50/0.1ml，备用。

（2）灭活将上述收获的新城疫病毒抗原和传染性支气管炎病毒抗原以（V/V）1:1混后，加入终浓度为0.1%的甲醛，于37℃，2000r/min搅拌，灭活16~24小时；

以下水相制备、油相制备、乳化、测定粒径和黏度和分装各工序同实施例2。

实施例6

——新城疫-禽流感H9亚型二联灭活疫苗的制备

（1）抗原制备

新城疫病毒A-VII株：毒种用无菌PBS做适当稀释，尿囊腔接种11日龄低免鸡胚，每胚104.0EID50/0.1ml。选接种后96小时死亡的鸡胚，置2～8℃冷却12小时，收获鸡胚液于专业灭菌容器中，病毒含量为108.5EID50/0.1ml，备用；

（2）灭活将上述收获的新城疫病毒抗原和禽流感H9亚型病毒抗原（V/V）1:1混合后加入终浓度为0.1%的甲醛，于37℃，2000r/min搅拌，灭活16~24小时；

以下水相制备、油相制备、乳化、测定粒径和黏度和分装各工序同实施例2。

实施例7

——疫苗检验

1. 疫苗粒径测定方法：

（1）打开欧美克LS900激光粒度分析仪预热30min，连接电脑上面对应的LS900V6.10B分析软件。

（2）打开LS900V6.10B分析软件，点击新建按钮。

（3）打开激光粒度仪测量单元门，取出静态样品池，加入2/3左右的蒸馏水（注意：将其中的气泡排干净），插入测量单元的进样插槽，关闭测量单元门。

（4）调零：点击背景，观察显示屏幕上的“背景光能分布”进行调零。（调零要求：零柱位于60~70之间，一柱在10以下，后面呈现递减趋势）。

（5）样品处理：将100 μl疫苗加入装有200ml蒸馏水的烧杯中，置于磁力搅拌器上，800 r/min搅拌2 min，混匀结束后，静置10 s。

（6）测样：打开激光粒度分析仪测量单元门，取出静态样品池，倒掉静态样品池中的蒸馏水，加入已经处理过的疫苗并使疫苗的量不超过静态样品池的2/3处（注意：将其中的气泡排干净），插入测量单元的进样插槽,关闭测量单元门。

（7）点击LS900V6.10B分析软件上的分析按钮，观察曲线分布图，保存图像于电脑中。

（8）静态样品池的清洗：倒掉静态样品槽中的样品，加入75%酒精浸泡1 min，用酒精对静态样品槽的槽盖进行润洗，接着用蒸馏水对静态样品槽及槽盖进行冲洗，洗净后用吹风机吹干并将静态样品槽插入进样插槽内，关闭激光粒度分析仪测量单元门。

（9）先关闭电脑，再关闭欧美克LS900激光粒度分析仪。

（10）对试验区域进行清场。

（11）结果判定：

1）因拟合残余数值的大小能直接表现激光粒度仪测试结果与疫苗实际粒子相近状况，故拟合残余数值越小，则颗粒度仪测试结果越准确。

2）粒度报告中遮光比数值越小，代表疫苗在介质中分散的越彻底。判定遮光比数值在10%左右。

3）符合两项条件即可判定该疫苗颗粒度测定结果可信。

2. 黏度测定方法：

（1）抽取待检样品（1瓶/批），置于操作台上平衡至室温。

（2）调平仪器：使用前检查仪器是否水平，若不水平可通过支架螺旋脚进行调节至水平。

（3）开启水浴锅：然后接通水浴锅的电源，打开水浴锅“POWER”开关，打开水浴锅上的“REFRIG”键，将“TEMP”调节杆拨到“SET”，通过调节上面的旋钮将温度设定为20.0℃，再将“TEMP”调节杆拨到“ACTUAL”,待水浴锅温度停留在20℃时，将疫苗放入水浴锅5-10min。

（4）将黏度计接通220V，50Hz电源，打开仪器后面的电源开关，显示屏显示仪器的型号及版本号等。

（5）锥（转子）/板（样品杯）间电子间隙设置：

1）调节开关移到右边，开启（启动）间歇设置功能。调节指示灯（红）发亮。

2）将如果滑动参考标记未处于中间位置，可手动调整至中间位置

3）如果接触灯（黄）亮起，顺时针（当你直视仪器时）调动满刻度标志，直至接触灯闪烁不停，调动滑动标志至最接近满刻度标志的刻度处，然后将满刻度标志向后调一个刻度，接触灯（黄）熄灭。如果黄色的接触灯不亮，逆时针（当你直视仪器时）调动满刻度标志，直至接触灯闪烁不停，按照上述方法使接触灯（黄）熄灭。

（4）设定完仪器所需要的间歇后，关闭调节开关（移到左侧）；红色的指示灯应该熄灭。

（6）参数设置：

1）将黏度计接通220V，50Hz电源，打开仪器后面的电源开关，显示屏显示仪器的型号及版本号等。

2）等待数秒后显示屏显示为：“REMOVE SPINDLEPRESS ANY KEY”，若按任意键。屏幕闪烁显示“AUTOZEROVISCOMETER”（自动调零），然后按任意键。

3）参数设置：进入主界面菜单，设置好所选用的转子型号，转速，测试时间。

4）测量样品：移开固定杆，取下样品杯，将置于20℃水浴锅内待测样品摇匀，然后利用100~1000 μL移液器向样品杯中加入500 μL的待检样品，装好样品杯，此时黏度计屏幕右上角会显示样品的温度，稍等待一下，当该温度数值显示为设定的温度时（如20.0℃），开始按下“RUN”键进行测试，运行1min至温度及黏度数据显示稳定时，进行读数，记录扭矩和黏度值，保存数据。

5）检测完毕，取下样品杯，用吸水纸或卷纸擦拭干净转子和样品杯。

6）关闭黏度计电源开关。然后用酒精棉擦拭一下样品杯内和转子表面的油污，最后将样品杯和转子放入抽屉中专用保存盒中。

（7）清理台面，处理废弃的疫苗，填写黏度计的使用运行记录。

（8）结果判定：

1）扭矩值大于40%小于70%时，结果可信。

2）疫苗黏度在0～50CP范围内，选择转速5 r/min；50～200CP范围内，选择1 rpm。

3）样品检测结果读取时间设置为1 min。

3. 效力检测方法：

（1）新城疫部分采用血清学方法进行检验，结果不符合规定时，可采用免疫攻毒法进行检验。

1）血清学方法用21~28日龄SPF鸡15只，10只各颈部皮下或肌肉注射灭活疫苗20μl，另5只作对照。接种后21~28日，每只鸡分别采血，分离血清，用A-Ⅶ株抗原测定新城疫HI抗体，免疫组鸡血清中新城疫HI抗体几何平均值应不低于1:64，对照组鸡血清HI抗体均应不高于1:4。

2）免疫攻毒法用21~28日龄SPF鸡15只，10只各颈部皮下或肌肉注射三联苗20μl，另5只作对照。接种后21~28日，每只鸡胸部肌肉注射NDV强毒JS02/06株0.5ml（含105.0ELD50），观察14日，记录鸡只发病死亡情况。于攻毒后5日，采集泄殖腔拭子，处理后，尿囊腔接种10~11日龄SPF鸡胚5枚，0.2ml/枚，孵育观察5日，无论死胚、活胚均应测定鸡胚液红细胞凝集价，每个拭子接种的5枚鸡胚中，只要有1枚鸡胚液的凝集价不低于1:16，即可判为病毒分离阳性；对病毒分离阴性的样品，应盲传一次后再进行判定。免疫组鸡应至少9只不出现新城疫的临床症状，且应至少7只病毒分离为阴性；对照组鸡应全部发病死亡。

（2）传染性支气管炎部分

用21~28日龄的SPF鸡15只，各经滴鼻点眼免疫H120活疫苗1羽份，21日后采血分离血清；其中10只鸡采血后胸部肌肉注射三联苗0.5ml，另5只不加免作对照。二免后21~28日，所有鸡采血分离血清。将两次血清分别作HI试验。二免血清的HI几何平均滴度应不低于首免血清HI几何平均滴度的4倍，采血后所有鸡用M41株攻毒，10倍稀释，每只滴鼻点眼0.5ml（约含5×106.5EID50），攻毒后第5天，剖杀鸡，取气管制成气管环，观察气管环纤毛摆动和破坏程度。

（3）H9亚型禽流感部分血清学方法和免疫攻毒法任选其一。

1）血清学方法用21~28日龄SPF鸡20只，其中10只颈部皮下或肌肉注射疫苗20μl，另10只不接种作对照。21~28日后采血分离血清，用H9亚型禽流感病毒WJ57株抗原测定HI抗体。免疫组鸡血清中H9亚型禽流感HI抗体效价的几何平均值应不低于1:64，对照组鸡血清HI效价均应不高于1:4。

2）免疫攻毒法用21~28日龄SPF鸡20只，10只各颈部皮下或肌肉注射灭活疫苗20μl，另10只不免疫作对照。接种后21~28日，每只鸡翅静脉注射10倍稀释的WJ57株0.2ml（病毒含量≥2×107.0EID50），于攻毒后3日，采集泄殖腔拭子，处理后，尿囊腔接种10~11日龄SPF鸡胚5枚，0.2ml/枚，孵育观察5日，无论死胚、活胚均应测定鸡胚液红细胞凝集价，每个拭子接种的5枚鸡胚中，只要有1枚鸡胚液的凝集价不低于1:16，即可判为病毒分离阳性；对病毒分离阴性的样品，应盲传一次后再进行判定。免疫组鸡应至少8只病毒分离为阴性；对照组鸡应至少9只病毒分离为阳性。

表1 乳化后疫苗测定的粒径分布表

粒径	微分分布	累积分布	粒径	微分分布	累积分布	粒径	微分分布	累积分布
0.05	0.00	0.00	1.16	0.00	100.00	26.96	0.00	100.00
0.06	0.00	0.00	1.45	0.00	100.00	33.75	0.00	100.00
0.08	0.00	0.00	1.82	0.00	100.00	42.25	0.00	100.00
0.10	0.01	0.01	2.28	0.00	100.00	52.89	0.00	100.00
0.12	0.02	0.04	2.85	0.00	100.00	66.21	0.00	100.00
0.15	0.12	0.15	3.57	0.00	100.00	82.89	0.00	100.00
0.19	0.57	0.72	4.47	0.00	100.00	103.76	0.00	100.00
0.24	2.58	3.31	5.59	0.00	100.00	129.90	0.00	100.00
0.30	10.22	13.53	7.00	0.00	100.00	162.62	0.00	100.00
0.38	36.06	49.58	8.77	0.00	100.00	203.58	0.00	100.00
0.47	44.09	93.67	10.98	0.00	100.00	254.85	0.00	100.00
0.59	6.33	100.00	13.74	0.00	100.00	319.04	0.00	100.00
0.74	0.00	100.00	17.20	0.00	100.00	399.40	0.00	100.00
0.93	0.00	100.00	21.53	0.00	100.00	500.00	0.00	100.00

表2 疫苗 2~8℃保存后性状、装量及无菌检验结果

疫苗批号	保存时间（月）	外观	性状			装量（ml）	无菌
疫苗批号	保存时间（月）	外观	剂型	稳定性	黏度（cP）	装量（ml）	无菌
1301	0	乳白色均匀乳剂	油包水型	管底无水相析出	29.4	101.1、101.3、102.0	合格
	3	乳白色均匀乳剂	油包水型	管底无水相析出	31.2	/	合格
	6	乳白色均匀乳剂	油包水型	管底无水相析出	34.8	/	合格
	9	乳白色均匀乳剂	油包水型	管底无水相析出	25.6	/	合格
	12	乳白色均匀乳剂	油包水型	管底无水相析出	32.9	102.2、101.3、102.4	合格
	18	乳白色均匀乳剂	油包水型	管底无水相析出	30.6	102.2、102.3、101.5	合格
	24	乳白色均匀乳剂	油包水型	管底无水相析出	25.5	101.1、102.6、101.5	合格
1302	0	乳白色均匀乳剂	油包水型	管底无水相析出	37.4	102.1、102.1、101.3	合格
	3	乳白色均匀乳剂	油包水型	管底无水相析出	25.8	/	合格
	6	乳白色均匀乳剂	油包水型	管底无水相析出	31.6	/	合格
	9	乳白色均匀乳剂	油包水型	管底无水相析出	26.7	/	合格
	12	乳白色均匀乳剂	油包水型	管底无水相析出	29.2	101.6、102.1、102.3	合格
	18	乳白色均匀乳剂	油包水型	管底无水相析出	36.5	102.7、102.4、101.5	合格
	24	乳白色均匀乳剂	油包水型	管底无水相析出	32.2	102.1、102.3、102.6	合格
1303	0	乳白色均匀乳剂	油包水型	管底无水相析出	31.0	102.1、102.3、102.5	合格
	3	乳白色均匀乳剂	油包水型	管底无水相析出	29.6	/	合格
	6	乳白色均匀乳剂	油包水型	管底无水相析出	31.9	/	合格
	9	乳白色均匀乳剂	油包水型	管底无水相析出	25.2	/	合格
	12	乳白色均匀乳剂	油包水型	管底无水相析出	26.6	102.7、101.3、102.4	合格
	18	乳白色均匀乳剂	油包水型	管底无水相析出	31.9	102.1、102.3、102.5	合格
	24	乳白色均匀乳剂	油包水型	管底无水相析出	34.2	102.8、102.5、101.5	合格

表3 2~8℃保存不同时间的效力检验

疫苗批号	保存时间（月）	检测项目（HI）	免疫剂量（ml）	HI抗体几何平均值（log2）	临床保护	分毒保护
1301	3	ND	0.02	8.0	10/10	10/10
		H9	0.02	6.8	10/10	10/10
		IB	0.5	3.8/6.7	10/10	/
	12	ND	0.02	7.9	10/10	10/10
		H9	0.02	7.0	10/10	9/10
		IB	0.5	3.8/6.6	10/10	/
	24	ND	0.02	7.5	10/10	9/10
		H9	0.02	6.7	10/10	9/10
		IB	0.5	4.0/6.8	9/10	/
1302	3	ND	0.02	8.0	10/10	10/10
		H9	0.02	7.8	10/10	9/10
		IB	0.5	3.9/6.6	10/10	/
	12	ND	0.02	7.7	10/10	9/10
		H9	0.02	7.3	10/10	9/10
		IB	0.5	4.0/6.7	10/10	/
	24	ND	0.02	7.6	10/10	9/10
		H9	0.02	7.4	10/10	9/10
		IB	0.5	3.7/6.7	10/10	/
1303	3	ND	0.02	7.4	10/10	10/10
		H9	0.02	7.1	10/10	10/10
		IB	0.5	3.6/6.7	10/10	/
	12	ND	0.02	7.5	10/10	10/10
		H9	0.02	7.0	10/10	9/10
		IB	0.5	3.8/6.9	9/10	/
	24	ND	0.02	7.2	10/10	9/10
		H9	0.02	6.8	10/10	8/10
		IB	0.5	3.9/6.7	9/10	/

在本说明书中所谈到的“实施例1”，指的是结合该实施例描述具体特征、结构或者特点。进一步来说，结合任一实施例描述一个具体特征、结构或者特点时，所要主张的是结合其他实例来实现这种特征、结构或者特点也落在本发明的范围内。
尽管这里参照本发明的实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本申请公开和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。