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说明书

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一种用SPF鸡制备鸡传染性支气管炎阳性血清的方法

技术领域
本发明涉及一种用SPF鸡制备鸡传染性支气管炎阳性血清的方法,属于兽用生物制品技术领域。

背景技术
鸡传染性支气管炎(Infection bronchitis)是由传染性支气管炎病毒(Infection bronchitis virus)引起的鸡的一种急性高度接触性呼吸道传染病,其临诊特征是呼吸困难、发出啰音、咳嗽、张口呼吸、打喷嚏。它主要侵害禽类的呼吸道与肾脏,此外有的血清型还能导致腺胃等消化系统器官病变。该病会使肉鸡体重增长缓慢,出笼效率降低;使蛋鸡产蛋数量和质量下降;使雏鸡发育不良并有较高的致死率。其在全世界都有分布,对禽类养殖业危害巨大,往往造成严重的经济损失。
    为减少本病对养鸡业造成的经济损失,鸡传染性支气管炎疫苗的研制与应用具有重大的意义。因此为保证该类疫苗产品质量,鉴别、效力、外源病毒检验是动物活疫苗质量检验的重点之一,这就需要特异性血清对样品进行中和处理。目前国内制备阳性血清通常采用SPF本动物或异源动物作为免疫受体。

发明内容
本发明的目的在于通过SPF鸡对鸡传染性支气管炎病毒刺激所产生免疫反应获得免疫抗体——阳性血清。
本发明技术方案:
1. 一种用SPF鸡制备鸡传染性支气管炎阳性血清的方法,其特征在于其制备的方法步骤为:
(1)用鸡传染性支气管炎抗原对SPF鸡进行滴鼻第一次免疫,15日后,用鸡传染性支气管炎活疫苗对SPF鸡进行免疫,共免疫四次;
(2)每次免疫前,采集的等量血液,制备血清,检测SPF鸡血清中抗体滴度;
(3)当SPF鸡血血清中抗体滴度达到210以上时,采集血液,将采集后的血液在37℃恒温水浴锅静置30min,然后离心分出血清,过滤,将过滤后的血清进行无菌分装、保存;
(4)无菌分装保存的血清,确保纯净,进行抗体检测,确定滴度。
2. 如权利要求1所述的一种用SPF鸡制备鸡传染性支气管炎阳性血清的方法,其特征在于其所述SPF鸡免疫的程序具体为:1日龄进行第一次免疫,免疫剂量为0.1~0.2ml;15日龄进行第二次免疫,免疫剂量为10羽份/只;30日龄进行第三次免疫,免疫剂量为10羽份/只;45日龄进行第四次免疫,免疫剂量为10羽份/只。
3. 如权利要求1 所述一种用SPF鸡制备鸡传染性支气管炎阳性血清的方法,其特征在于所述鸡传染性支气管炎抗原效价为106.0EID50/ ml,每只鸡免疫剂量为0.1~0.2ml。
4. 如权利要求1 所述一种用SPF鸡制备鸡传染性支气管炎阳性血清的方法,其特征在于其中步骤(3)中给鸡采血时间为每次免疫后15天,再次免疫前,最后一次采血时间为免疫后14天。
5. 如权利要求1 所述一种用SPF鸡制备鸡传染性支气管炎阳性血清的方法,其特征在于其中步骤(4)中采用3000r/min 对静置后鸡血离心10min,然后分离血清并用0.22µm一次性滤器过滤。
6. 如权利要求1所述一种用SPF鸡制备鸡传染性支气管炎阳性血清的方法,其特征在于,所述阳性血清的抗体滴度为210。
本发明具体实施方式
1. 免疫抗原的制备
制备鸡传染性支气管炎抗原用的毒株为H120、H52弱毒株;均购自中国兽医药品监察所中国兽医微生物菌种保藏管理中心。
将传染性支气管炎H120株和H52毒株等量混合,做2.5倍的稀释处理,制备成鸡传染性支气管炎抗原:
鸡传染性支气管炎活疫苗(H120株)购自青岛易邦生物工程有限公司。
2. 鸡传染性支气管炎病毒阴性血清的制备方法:
     选用15日龄SPF鸡饲养于负压隔离器内,采集血液制备鸡传染性支气管炎阴性血清。对分装保存的阴性血清进行HI试验,检验外源病毒、支原体和细菌,确定滴度和纯净性(见表1)。
3.鸡传染性支气管炎病毒阳性血清的制备方法
初免:对1日龄用鸡传染性支气管炎抗原免疫,0.1~0.2ml滴鼻;15日龄时,用翅下静脉采血方式采集2ml血液,分离血清,进行HI效价测定,同时进行第二次免疫:用鸡传染性支气管炎活疫苗进行免疫,点眼滴鼻;30日龄时,用翅下静脉采血方式采集2ml血液,分离血清,进行HI效价测定,进行第三次免疫:用鸡传染性支气管炎活疫苗进行免疫,点眼滴鼻;45日龄时,用翅下静脉采血方式采集2ml血液,分离血清,进行HI效价测定,同时进行第四次免疫:用鸡传染性支气管炎活疫苗进行免疫,点眼滴鼻。15天后(60日龄),用翅下静脉采血方式采集2ml血液,分离血清,进行效HI价测定。抗体滴度达到210以上时,即确定为采血时间。
采集后的血液放入37后恒温水浴锅静置30min,然后3000r/min离心10min,分离血清,再用0.22µm滤膜过滤,将过滤后的血清进行无菌分装、保存,0.5ml/瓶。
对分装保存的血清抽样进行HI试验,检验外源病毒、支原体和细菌,确定滴度和纯净性。

本发明涉及的生物材料资源信息
鸡传染性支气管炎病毒(Infection bronchitis virus)H120株、H52株:均从中国兽医药品监察所中国兽医微生物菌种保藏管理中心所购买(请见中国兽医药品监察所,中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著,中国兽医菌种目录,第二版,2002年,中国农业科学技术出版社,p136),本公司实验室保存;鸡传染性支气管炎活疫苗(H120株):从青岛易邦生物工程有限公司购买,本公司实验室保存。

本发明的积极意义
本发明公开了一种用SPF鸡制备鸡传染性支气管炎阳性血清的方法。其包括免疫动物选择、免疫接种方式、时间间隔、免疫次数、鸡血采集、血清制备及检验。本发明通过鸡传染性支气管炎抗原和活疫苗免疫SPF鸡制备阳性血清,该阳性血清是鸡传染性支气管炎准确诊断、免疫监测及对其疫苗免疫效果进行准确评价的基本保障,提高鸡传染性支气管炎病的防控水平。为鸡传染性支气管炎病的监测和相关兽用生物制品的质量评价提供有力的技术支撑,具有很好的应用前景。

实施例
    以下实施例为进一步说明本发明,不构成对本发明的限制。
实施例1
——免疫抗原的制备
用无菌生理盐水分别将鸡传染性支气管炎病毒H120株和H52株毒种稀释10~100倍,以0.1ml接种10~11日龄的SPF鸡胚尿囊腔,37℃孵化30~36小时,弃死胚,置2~8℃冰箱6~8小时后,收获鸡胚液,将收获的传染性支气管炎H120株和H52株病毒液按(V/V)等量混合,做2.5倍的稀释处理后进行检验,检验合格后即为鸡传染性支气管炎抗原作为免疫抗原(检验结果见表1)。
表1  免疫抗原检测结果


样品

检测项目

无菌检验

支原体检验

外源病毒检测

病毒含量

免疫抗原

无菌生长

无支原体生长

无外源病毒

106.5EID50/0.1ml

实施例2
——鸡传染性支气管炎病毒阴性血清的制备方法:
选用15日龄SPF鸡饲养于负压隔离器内,无菌采集血液并采集血清后进行检验,检验合格后成鸡传染性支气管炎阴性血清,检验结果见表2。
实施例3
——鸡传染性支气管炎病毒阳性血清的制备
(1)初免:鸡传染性支气管炎抗原免疫,每只鸡0.1~0.2ml滴鼻。
(2)15天后,用翅下静脉采血方式采集2ml血液,分离血清,进行HI效价测定,检测抗体为22。
(3)第二次免疫:用鸡传染性支气管炎活疫苗进行免疫,点眼滴鼻。
(4)15天后,用翅下静脉采血方式采集2ml血液,分离血清,进行HI效价测定,检测抗体为27。
(5)第三次免疫:用鸡传染性支气管炎活疫苗进行免疫,点眼滴鼻。
(6)15天后,用翅下静脉采血方式采集2ml血液,分离血清,进行HI效价测定,检测抗体为29。
(7)第四次免疫:用鸡传染性支气管炎活疫苗进行免疫,点眼滴鼻。
(8)15天后,用翅下静脉采血方式采集2ml血液,分离血清,进行效HI价测定,检测抗体为210。
(9)抗体滴度达到210以上时,即确定为采血时间。
(10)采集后的血液放入37℃恒温水浴锅静置30min,然后3000r/min离心10min,分离血清,再用0.22µm滤膜过滤,将过滤后的血清进行无菌分装、保存,0.5ml/瓶。
(11)无菌条件下,对分装保存的血清进行HI试验,检验外源病毒、支原体和细菌,确定滴度和纯净性,检测结果见表2。
表2  鸡传染性支气管炎病毒阴性和阳性血清的检验结果


样品

检测项目

无菌检验

支原体检验

外源病毒检测

HI

阴性血清

无菌生长

无支原体生长

无外源病毒

20

阳性血清

无菌生长

无支原体生长

无外源病毒

210